Endotoxine - Wirkung und Nachweisverfahren

Endotoxine kommen in der Zellwand gramnegativer Bakterien und Blaualgen vor. Ihre Wirkung auf den Menschen ist von verschiedenen Faktoren abhängig. Entscheidend sind zum einen Eintrittspforte, Wirkort und Konzentration zum anderen die Empfindlichkeit der betroffenen Person. In der Arbeitswelt kommt es in der Regel zu einer inhalativen Endotoxinexposition. Diese ruft eine Reihe von zellulären Abwehrmechanismen in der Lunge hervor. Im Rahmen des BGFA-Projektes Imm 14 soll die vorliegende Literatur unter besonderer Berücksichtigung der Bestimmung der Endotoxinaktivität gesichtet und etwaiger Forschungsbedarf formuliert werden.

Abb.1: Endotoxine kommen überall vor.

Der Begriff "Endotoxine" wurde 1904 von Richard Pfeiffer, einem Schüler von Robert Koch, geprägt, der in Versuchen an Meerschweinchen neben dem hitzelabilen Exotoxin von Cholerabakterien (Vibrio cholerae) ein hitzestabiles Prinzip differenzieren konnte, das beim Absterben der Bakterien freigesetzt wurde. Endotoxine kommen in der Zellwand gramnegativer Bakterien und Blaualgen vor. Biochemisch handelt es sich um Lipopolysaccharide (LPS), die sich aus speziesspezifisch unterschiedlichen Polysaccharidketten und einem relativ einheitlichen Lipid (Lipid A) zusammensetzen. Oft werden die Begriffe Endotoxin und Lipopolysaccharid als Synomym gebraucht. Endotoxine sind thermostabil. Ihre toxischen Eigenschaften sind durch das Lipid A bedingt seine Aktivität wird allerdings durch den Polysaccharid-Anteil modifiziert.

• akute Effekte nach einmaliger Exposition
• Effekte nach wiederholter Exposition über einen längeren Zeitraum
• Effekte nach gleichzeitiger Exposition gegenüber Endotoxin und anderen Substanzen.

Vor diesem Hintergrund der unterschiedlichen Symptomausprägung stellt sich die Frage nach Dosis-Wirkungsbeziehungen besonders dringlich. Um solche komplexen Zusammenhänge erforschen zu können, sind standardisierte Messmethoden unabdingbar. Da es viele Arbeitsplätze gibt, die hohe Endotoxinbelastungen aufweisen, wie etwa die Landwirtschaft oder die baumwollverarbeitende Industrie (2,3), wurde die Endotoxinforschung von den Berufsgenossenschaften als relevantes Forschungsthema benannt. In einem ersten Schritt sollte die vorliegende Literatur unter besonderer Berücksichtigung der Bestimmung der Endotoxinaktivität gesichtet und etwaiger Forschungsbedarf formuliert werden.

Dass die Endotoxinexposition im frühen Kindesalter protektiv im Hinblick auf eine spätere Allergieentwicklung sein kann, wurde von großen epidemiologischen Untersuchungen gestützt, die für Kinder, die auf Bauernhöfen aufwuchsen, ein im Vergleich zu Stadtkindern deutlich vermindertes Risiko für die Entwicklung einer Atopie zeigten (4). Auf molekularer Ebene ergibt sich ein Zusammenhang zwischen CD14-Polymorphismen und Atopiehäufigkeit. Die unterschiedliche Endotoxinexposition der Stadt- und Landkinder in der Wohnumgebung (und im Stall) wird entsprechend als Korrelat dieser protektiven Wirkung vermutet. Hintergrund dieser Tatsache ist die Annahme, dass Endotoxine und andere Zellwandbestandteile durch Interaktion mit den körpereigenen Endotoxin-Rezeptormolekülen CD14 die Serum-IgE-Konzentration in ähnlicher Weise reduzieren können, wie es für CD14-Polymorphismen gezeigt wurde. Die durchschnittliche Endotoxinexposition von Kindern in bäuerlichen Familien und von Altersgenossen aus Familien, die nicht auf dem Land leben, wurde durch die Untersuchung von Staubproben aus den Ställen, der Küche und den Matratzen der Kinder erfasst. Die höchsten Endotoxinkonzentrationen ließen sich im Stallstaub nachweisen. Hinsichtlich der Innenraum-Endotoxinbelastung unterschieden sich die staubgebundenen Endotoxinkonzentrationen signifikant bei Stadt- und Landkindern, wobei für letztere jeweils die höheren Konzentrationen gefunden wurden.

Außerdem konnte in einigen Untersuchungen eine inverse Beziehung zwischen Endotoxinexposition und dem Risiko für Lungenkrebs nachgewiesen werden. Die Ursache hierfür kann in einer Aktivierung des Immunsystems, speziell der Makrophagen und verschiedener tumorhemmender Zytokine wie TNF-a liegen. Diese positiven Wirkungen des Endotoxinkontakts bedürfen sicher noch weiterer Überprüfung, um die Konsequenzen entsprechender Expositionen abschätzen zu können (1).

Arbeitsmedizinisch ist dagegen der grundsätzliche Zusammenhang zwischen einer Endotoxinbelastung und berufsbedingten Erkrankungen erwiesen (5). Akute Endotoxininhalationen können Husten, Beeinträchtigungen der Lungenfunktion und grippeähnliche Symptome hervorrufen. Dauerexposition kann zu chronischer Bronchitis führen. Schon lange bekannt ist dabei der Zusammenhang von Endotoxinbelastung und Lungenfunktionsveränderung (FEV₁) bei Baumwollarbeitern (2,3). Aber die Arbeitsplätze mit Endotoxinbelastungen sind vielfältig und reichen von der Schweinezucht über Geflügelschlachtereien bis hin zur Metall-verarbeitenden Industrie.

Der Schwerpunkt der BGFA-Literaturauswertung liegt auf Untersuchungen im Zusammenhang zwischen Endotoxinexposition und Entstehung von Atemwegsbeschwerden im beruflichen Kontext. In die tabellarische Auswertung gehen dabei die Charakterisierung der Untersuchungsgruppe, die Beschreibung des Arbeitsplatzes und der verwendeten Endotoxinmessmethoden sowie ermittelten Endotoxinkonzentrationen ein.

Abb.2: Schema der zellulären Reaktion bei Endotoxin (LPS)-Kontakt (Für eine vergrößerte Darstellung bitte auf die Abbilung klicken.)

1. CD14 (Expression des Rezeptor auf Alveolarmakrophagen bzw. Blutmonozyten)
2. LBP (=Lipopolysaccharid-Bindeprotein)
3. Inflammatorische Mediatoren, die nach Endotoxinbindung an CD14 von Makrophagen/Monozyten freigesetzt werden: IL-6/IFNg/IL-1b/IL-8
4. BPI (Bacterial-Permeability-Increasing Protein), das aus aktivierten Neutrophilen freigesetzt wird
5. sCD14 (Konzentration im Serum)

Abb.3: Am BGFA wurde der PyroCheck® zum Nachweis der Endotoxinaktivität etabliert.

Der LAL-Test ist sehr sensitiv, aber auch störanfällig und es handelt sich auch hier um einen Tierversuch mit den entsprechenden Einschränkungen für die Übertragbarkeit auf den Menschen. Mit diesem Verfahren werden ungebundene Lipopolysaccharidmoleküle nachgewiesen. Sind die Moleküle aktiv, bewirken sie die Freisetzung von Botenstoffen aus den Zellen. Sie liegen jedoch außerhalb des Körpers nur teilweise frei vor und werden erst nach z.B. Phagozytose eingeatmeter Partikel freigesetzt. Bei Verwendung des Limulustests (Aktivitätstest) können so - entsprechend der Angaben von Rylander (1) - bis zu 30 - 50-fach niedrigere Werte gemessen werden als bei einem Endotoxinnachweis, der nur die chemische Verbindung aber nicht die Aktivität der Moleküle berücksichtigt. Neue Ansätze verwenden die Bestimmung charakteristischer 3-Hydroxy-Fettsäuren der Lipopolysaccharide zur Endotoxinquantifizierung mit Hilfe der Gaschromatographie/Massenspektrometrie-Kopplung an. Die untere Nachweisgrenze kann etwa bei 50 fmol liegen, was einer Lipopolysaccharid-Konzentration von ca. 5ng/Probe entspricht. Im ebenfalls neu entwickelten Verfahren des PyroCheck® werden nicht die Endotoxine direkt nachgewiesen, sondern allgemein Substanzen, die zur Freisetzung von Interleukin-1b bzw. anderer Mediatoren wie IL-6 führen können. Die Nachweisgrenze liegt hier bei ca. 10 pg/ml Lipopolysaccharid. Für beide neuen Nachweisverfahren steht die Standardisierung für den Einsatz in der arbeitsmedizinisch-sicherheitstechnischen Praxis und Forschung derzeit noch aus.

Für die Ableitung von Dosis-Wirkungsbeziehungen wurden bislang Daten der Endotoxinbestimmung mittels LAL-Tests herangezogen, die entsprechend mit Einschränkungen zu betrachten sind. Der Arbeitskreis Arbeitsplatzbewertung des UA1 unterstützt deshalb die Erforschung von alternativen Messverfahren. Die Einbeziehung des PyroCheck® wird daher auch vor dem Hintergrund der Erkenntniserweiterung bei der Beurteilung adverser Endotoxineffekte und der Ermittlung ggf. von "gesundheitsbasierten Schwellenwerten" erwünscht. Im BGFA konnte der so genannte PyroCheck® (=whole blood assay) etabliert und seine Einsetzbarkeit bei arbeitsmedizinisch relevanten Fragestellungen z.T. schon überprüft werden (siehe auch (siehe auch Überprüfung von Befeuchterwasser im BGFA-Info 1/2002). Dieses Verfahren ermöglicht durch den Nachweis der freigesetzten inflammatorischen Mediatoren wie IL-6 und IL-1b den (indirekten) Nachweis von pyrogenen Substanzen. Im Sinne der Standardisierung soll das BGFA die Ergebnisse des PyroCheck® mit denen des LAL-Tests vergleichen. Dies erfolgt in Zusammenarbeit mit dem Berufsgenossenschaftichen Institut für Arbeitschutz (BIA), wo der LAL-Test zum Standard-Methodenrepertoire gehört, unter Verwendung von identischem Ausgangsmaterial (z.B. Extrakte von Staubfiltern oder Befeuchterwasserproben).

Zusammenfassend zeigt sich, dass die bisher existierenden Untersuchungen aufgrund der unterschiedlichen Probennahmeverfahren und Endotoxinmessungen schwer vergleichbar sind. Der von der DECOS (Dutch expert committee on occupational standards) vorgeschlagene gesundheitsbasierte Grenzwert von 50 EU/m³ (entspricht 5 ng/m³) kann nur dann sinnvoll eingesetzt werden, wenn international vergleichbare Messungen der Endotoxinbelastungen möglich sind. Forschung mit dem Ziel standardisierter Messverfahren kann hier in Zukunft helfen, klarere Aussagen zu treffen, auf deren Basis eine Richtwertdiskussion erst konstruktiv geführt werden kann. In den Niederlanden wird eine schrittweise Einführung des Grenzwertes von 50 EU/ m³ angestrebt. Beginnend mit 200 EU/m³ in der Übergangszeit soll bis 2005 der Wert von 50 EU/m³ erreicht sein.

1. Rylander R: Endotoxin in the environment – exposure and effects. Review J of Endotoxin research 2002; 8
2. Christiani C, Ye T, Zhang S, Wegman D, Eisen E, Ryan L, Olenchock S, Pothier L, Dai H: Cotton dust and endotoxin exposure and long term decline in lung function: results of a longitudinal study. American Journal of Ind Medicine 1999;35: 321-331
3. Kennedy S, Christiani D, Eisen E, Wegman D, Greaves I, Olenchock S, Ye T, Lu P: Cotton dust and endotoxin exposure-response relationships in cotton textile workers. Am Rev Respir Dis 1998; 135: 194-200
4. v. Mutius E, Braun-Fahrländer C, Schierl R, Riedler J, Ehlermann S,Maisch S, Waser M, Nowak D: Exposure to endotoxin or other bacterial components might protect against the development of allergy. Clin and Exp Allergy 2000 ;30: 1230-1234
5. Heederik D, Douwes J: Towards an occupational exposure limit for endotoxins? Ann Agric Environ Med 1997, 4, 17-19